Figure 1 HPSEC elution profile of the DNP; O-toluidine blue-stained electrophoregram of the DNP (insert, Hep – heparin, CS – chondroitin sulfate).

        DNP因硫酸化模式不均一导致NMR图谱信号复杂重叠，难以全面解析，因此将其脱硫酸化获得衍生物dS-DNP。结合一维及二维NMR图谱分析可知，dS-DNP主要由α-L-艾杜糖醛酸与β-D-N-乙酰半乳糖胺两种单糖残基构成，图谱中可识别出两类糖残基对应的端基氢、端基碳，以及N-乙酰基、羟甲基、羰基等特征结构信号（Figure 2-4）。

Figure 2. ¹³C NMR spectra of the DNP (A) and dS-DNP (B).

        继续借助多种二维核磁共振图谱完成dS-DNP的信号解析，确认其由α-L-艾杜糖醛酸与β-D-N-乙酰半乳糖胺构成，明确了两类残基的糖苷键构型、取代位点与糖基化位置；结合残基间相关信号，判定dS-DNP主链为[→4)-α-L-IdopA-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→]的线性硫酸皮肤素结构。

Figure 3. ¹H,¹³C HSQC (A) and fragments of ¹H, ¹H ROESY (B) and ¹H,¹³C HMBC (C) spectra of dS-DNP.

Figure 4. ¹H, ¹³C HSQC spectrum of DNP.

        继续对硫酸化模式进行解析：相较于脱硫酸化产物，DNP中α-L-艾杜糖醛酸残基因硫酸化修饰出现显著低场位移，其主要为2,3-二硫酸化形式，同时还存在少量2-单硫酸化、3-单硫酸化亚型；β-D-N-乙酰半乳糖胺残基则主要在4位发生硫酸化，以上即为DNP的硫酸化组成特征（Figure 5）。

        研发出血风险更低的新型抗凝药物，一直是心血管领域的研究重点。活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）是三类经典体外凝血检测指标，分别用于评估凝血内源性途径、外源性途径以及纤维蛋白生成的终末阶段，也是筛选天然抗血栓活性物质的核心手段。本研究以普通肝素和依诺肝素作为对照，在人血浆中开展活性评价（Figure 6），结果显示DNP的抗凝作用具有剂量依赖性。该多糖对内源性凝血通路的抑制效果不及两种对照药物，对外源性凝血通路基本无明显作用；但在调控凝血终末环节上表现突出，抗凝活性与肝素持平，且显著强于依诺肝素，形成了区别于传统抗凝药物的作用特征。

Figure 6. Anticoagulant activity of DNP (blue), Clexane® (orange), and heparin (gray). (A) APTT, (B) TT, and (C) PT assays.

        为阐明作用机制，本研究在抗凝血酶Ⅲ（AT）存在条件下，采用生色底物法评价DNP对凝血因子Xa与凝血酶（Ⅱa）酰胺水解活性的抑制作用。该物质对凝血因子Xa仅表现出中等抑制活性，作用效果弱于肝素与依诺肝素；对凝血酶Ⅱa的抑制活性则与肝素相近且略优（Figure 7）。缺失抗凝血酶Ⅲ后DNP丧失凝血酶抑制能力，说明其抗凝作用依赖抗凝血酶Ⅲ介导。这一活性特点也合理解释了凝血检测结果：强效抑制凝血酶使其显著延长TT，而偏弱的抗因子Xa活性，导致其对APTT、PT的影响相对有限。

Figure 7. Effect of DNP (blue), Clexane® (orange), and heparin (gray) on the amidolytic activity of activated factors in the presence of AT. (A) anti-Xa activity, (B) anti-IIa activity.

        传统类肝素活性物质主要通过抑制内源性凝血通路与凝血因子Xa发挥抗凝作用，而DNP展现出截然不同的作用特征，可优先靶向凝血级联反应的终末阶段，核心依赖选择性抑制凝血酶的方式实现抗血栓效果。该多糖对凝血因子Xa介导的凝血早期放大过程干预作用较弱，不会广谱抑制整条凝血通路，相较于常规广谱抗凝药物，能够最大程度减少对机体正常凝血生理过程的干扰，有望形成更安全、更优质的治疗窗口，有效规避传统抗凝药普遍存在的出血风险弊端。这种差异化的抗凝机制，打破了传统肝素类物质的作用局限，赋予了海星来源DNP独特的抗血栓药理特性，具备新型抗凝候选药物的核心优势。

        血小板功能调控是多糖类物质抗血栓的重要途径，本研究进一步验证了DNP对血小板活性的调控作用及特异性。实验结果表明，DNP无直接活化血小板的作用（Figure 8A），同时不会干扰二磷酸腺苷（ADP）介导的生理性血小板聚集通路，不影响P2Y1、P2Y12嘌呤能受体信号传导，能够保留机体正常的止血功能（Figure 8B）。与此同时，DNP可显著抑制瑞斯托菌素诱导的血小板聚集，通过阻断血管性血友病因子（vWF）与血小板GPIb-V-IX受体的结合，有效抑制血小板黏附与异常聚集，且同等实验条件下其抑制效果优于普通肝素（Figure 8C）。综上，DNP兼具抗凝血酶Ⅲ依赖的强效凝血酶抑制活性与特异性vWF-GPIb通路调控作用，双重靶向凝血终末反应与血小板异常黏附过程，同时保留生理性止血功能，整体止血平衡特性优异，是极具研发价值的新型海洋源抗血栓活性物质。

Figure 8. A-Representative platelets aggregation trace induced by 20 μM adenosine diphosphate (ADP), by 5 and 100 μg/mL DNP and heparin in PRP. B-Representative platelets aggregation trace showing inhibition of 20 μM ADP-induced platelet aggregation in the presence of different concentration of DNP and heparin in PRP. C-Representative platelets aggregation trace showing inhibition of 15 mg/mL ristocetin-induced platelet aggregation in the presence of different concentration of DNP and heparin in PRP.

总结

本研究成功分离并解析了日本轮海星来源新型类硫酸皮肤素多糖DNP的精细结构，该多糖拥有保守的硫酸皮肤素主链与独特的混合型硫酸化修饰模式，以2,3-二硫酸化α-L-艾杜糖醛酸和4-单硫酸化β-D-N-乙酰半乳糖胺为主要结构特征，与已知棘皮动物糖胺聚糖存在明显结构差异。功能结果表明，DNP为抗凝血酶依赖性抗凝多糖，具有强抗凝血酶、弱抗Xa的差异化活性特征，优先作用于凝血终末阶段，展现出区别于其他海星多糖的独特抗凝谱；同时DNP不诱发血小板聚集、不影响生理性ADP血小板通路，却可特异性抑制vWF-GPIb介导的病理性血小板黏附聚集。本研究不仅拓展了海星糖胺聚糖的结构与功能多样性认知，也证实海星多糖是新型低出血风险抗血栓候选资源，为DNP进一步的体内研究与血栓疾病转化应用奠定了理论基础。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0144861726006090#s0105

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