文章题目：Sulfated galactofucan from Sargassum fusiforme protects against postmenopausal osteoporosis by regulating bone remodeling.

发表期刊：Communications Biology

影响因子：4.7（2024）

通讯单位：浙江省人民医院浙江省老年病学重点实验室；浙江工业大学生物工程学院；浙江省人民医院骨科

绝经后骨质疏松（PMOP）是中老年女性高发的退行性骨病，由雌激素缺乏引发骨代谢失衡，骨吸收远大于骨形成，最终导致骨量流失、骨微结构破坏，引发脆性骨折风险。临床抗骨质疏松药物多以抑制破骨细胞（OC）活性为主，长期使用易引发颌骨坏死、非典型股骨骨折等严重副作用，且目前缺乏能有效促进成骨细胞（OB）分化的临床药物，骨质疏松的临床治疗仍面临诸多困境。羊栖菜来源的岩藻聚糖（SF）作为天然硫酸化多糖，已被证实具有抗骨吸收、促骨形成的潜在价值，但此前研究多聚焦粗多糖组分，其具体骨保护活性成分、精细结构及核心作用机制尚未明确。因此，作者通过分离、纯化、降解羊栖菜岩藻聚糖，结合构效关系分析筛选出最优活性组分SFW-0.5-O，系统探究其体外调控骨重塑、体内改善去卵巢小鼠骨质疏松的作用及分子机制，为骨质疏松的天然药物研发提供了新型候选物和理论依据。

作者首先采用酸提（SFS）、碱提（SFJ）、热水提（SFW）三种方法从羊栖菜中提取岩藻聚糖（图1A），MTT 实验证实10 μg/mL浓度下三种提取物均无显著细胞毒性。通过酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色验证其对核因子 κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的破骨细胞分化的抑制作用，结果显示热水提物 SFW 的抑制效果最优，对破骨细胞分化的抑制率超 90%（图1B、1C）；实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）实验检测破骨分化相关基因表达，发现SFS和SFW能显著下调Trap、Dc-Stamp、NFATc1、ATP60等基因转录水平，SFJ 无显著抑制效果（图1D）；蛋白印迹实验进一步探究IRF-8/NFATc1信号通路的表达变化，发现RANKL处理后促破骨分化的c-Fos、NFATc1及IRF-8抑制亚基Blimp-1表达上调，IRF-8表达下调，而SFS和SFW可逆转该蛋白表达变化，且SFW对IRF-8的上调作用显著优于SFS（图1E-1I）。因此，作者选择SFW开展后续的纯化与改性研究。

图1 三种提取方法得到的SF对破骨细胞分化的抑制作用

为筛选SFW中抗破骨分化的核心组分，作者将SFW经阴离子交换柱纯化，洗脱得到 SFW-0、SFW-0.5、SFW-2三个组分（图2A），TRAP染色与qPCR实验证实SFW-0.5对破骨细胞分化的抑制活性最强，可使视野内破骨细胞数量和大小减少超95%（图2B-2D），随后通过过氧化氢氧化降解SFW-0.5和SFW-2，得到仅分子量降低的低分子量组分SFW-0.5-L和SFW-2-L（图2E），TRAP染色与qPCR实验显示SFW-0.5-L的抗破骨活性与SFW-0.5相当，且低分子量岩藻聚糖的活性显著优于原组分（图2F-2H）；进一步采用盐酸对SFW-0.5和SFW-2进行脱硫酸化处理，经分离得到不同硫酸基含量的组分（图2I、2J），其中SFW-0.5-O对破骨相关基因的抑制作用最为显著（图2K-2M），而SFW-2的脱硫酸化组分仅能减少破骨细胞大小，对细胞数量和相关基因表达无显著抑制效果（图2N-2P），证实SFW-0.5-O是羊栖菜岩藻聚糖中抗破骨分化的核心活性组分，且岩藻聚糖抑制破骨分化的活性与硫酸基含量无显著关联。

图2 SF的分子量和脱硫作用对破骨细胞生成的抑制效果

随后作者采用Bio-Gel P-10凝胶柱对SFW-0.5-O进行进一步纯化，以0.2 M碳酸氢铵为流动相洗脱得到6个组分，绘制得到洗脱曲线（图3A），电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析显示A1-A3组分成分复杂无法检测，A4主要为四硫酸化半乳岩藻聚糖五聚体（F4GS4），A5为二硫酸化岩藻聚糖三聚体（F3S2），A6为单硫酸化岩藻聚糖二聚体（图 3B-3H）。

图3 SFW-0.5-O的纯化表征

基于细胞毒性实验结果，作者设置了2.5、5、10μg/mL三个浓度梯度，来探究SFW-0.5-O体外调控骨重塑的双重作用。TRAP染色结果显示，SFW-0.5-O能剂量依赖性抑制RANKL诱导的破骨细胞形成（图4A、4B）；免疫荧光实验发现其可破坏破骨细胞成熟的标志性肌动蛋白环组装（图4C）；qPCR实验检测发现，SFW-0.5-O能剂量依赖性下调破骨分化相关基因Trap、Dc-Stamp、NFATc1、ATP60表达，同时逆转RANKL对IRF-8的抑制作用、下调 Blimp-1表达（图4D-4G）；蛋白印迹实验进一步验证，SFW-0.5-O可剂量依赖性下调c-Fos、NFATc1、Blimp-1蛋白表达，上调IRF-8蛋白表达，最终抑制破骨细胞分化（图4H、4I）。此外，SFW-0.5-O能显著促进成骨前体细胞MC3T3-E1的分化，使成骨早期标志物碱性磷酸酶（ALP）活性提升超2倍（图4J），且在10μg/mL 浓度下能使骨矿化结节形成能力提升近4倍（图4K、4L）；qPCR与蛋白印迹实验证实，其能剂量依赖性上调成骨分化相关基因 ALP、Runx2（图4M）及蛋白ALP、Osterix、Col-1表达（图4N、4O），充分证实SFW-0.5-O 有抑破骨、促成骨的双重体外骨保护作用。

图4 SFW-0.5-O抑制破骨细胞分化并促进成骨细胞分化

为验证SFW-0.5-O的体内骨保护效果，作者构建了去卵巢（OVX）小鼠绝经后骨质疏松模型，制定了完整的动物实验流程（图5A）。结果显示，SFW-0.5-O能有效缓解去卵巢引发的小鼠体重异常增加（图5B）；ELISA血清标志物检测表明，其能剂量依赖性提升骨形成标志物I型前胶原N端肽（PINP）、降低骨吸收标志物β-胶原交联（β-CTx），有效改善去卵巢小鼠的骨代谢失衡（图5C、5D）。Micro-CT三维重建显示，SFW-0.5-O能显著改善小鼠股骨松质骨和皮质骨的骨微结构（图5E）。骨参数分析显示，20 mg/kg SFW-0.5-O 能显著提升小鼠股骨骨密度（BMD），增加骨体积/组织体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th），降低骨小梁分离度（Tb.Sp），有效逆转去卵巢引发的骨微结构退化（图5F-5J）。此外，从各组小鼠股骨分离骨髓单核细胞（BMMs）并体外诱导破骨分化，qPCR实验发现SFW-0.5-O能剂量依赖性下调破骨相关基因表达、上调IRF-8表达（图5K、5L），蛋白印迹实验也验证了其对破骨分化相关蛋白的调控作用，高剂量SFW-0.5-O可使IRF-8表达恢复至基础水平的90%（图5M、5N），与体外细胞实验结果高度一致。

图5 SFW-0.5-O预防骨质流失

总之，作者首次通过系统的构效关系分析，从羊栖菜中筛选并鉴定出具有显著骨保护作用的硫酸化半乳岩藻聚糖活性组分SFW-0.5-O，明确了其主链结构。研究证实SFW-0.5-O通过上调IRF-8信号通路，在体外实现了剂量依赖性的“抑破骨、促成骨”双重骨重塑调控效应，在体内能有效改善去卵巢小鼠的骨代谢失衡和骨微结构退化，显著缓解绝经后骨质疏松症状。该研究不仅明确了羊栖菜岩藻聚糖的核心骨保护活性组分及精细结构，为开发新型天然抗骨质疏松药物提供了优质候选物，也为海洋硫酸化多糖在骨代谢疾病中的开发与应用奠定了重要的实验和理论基础。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s42003-024-07097-2

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作者：付钧

审核：李全才、邵萌

编辑：郭青云

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